Scoperta e ingegneria razionale dell'idrolasi del PET con proprietà idrolasi del PET sia mesofile che termofile

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4556 (2023) Citare questo articolo

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Un eccesso di rifiuti di polietilene tereftalato (PET) causa una serie di problemi. È stata condotta un'ampia ricerca incentrata sullo sviluppo di idrolasi PET superiori per il bioriciclaggio del PET. Tuttavia, gli enzimi modello utilizzati nell'ingegneria enzimatica si sono concentrati principalmente sull'IsPETasi e sulla cutinasi del compost dei rami fogliari, che presentano rispettivamente proprietà idrolitiche mesofile e termofile. Qui, riportiamo un'idrolasi del PET da Cryptosporangium aurantiacum (CaPETase) che presenta un'elevata termostabilità e una notevole attività di degradazione del PET a temperatura ambiente. Scopriamo la struttura cristallina della CaPETasi, che mostra una distinta conformazione della spina dorsale nel sito attivo e residui che formano la fessura di legame del substrato, rispetto ad altre idrolasi del PET. Sviluppiamo ulteriormente una variante CaPETaseM9 che mostra una robusta termostabilità con una Tm di 83,2 ° C e un'attività idrolitica del PET potenziata di 41,7 volte a 60 ° C rispetto a CaPETaseWT. CaPETaseM9 decompone quasi completamente la polvere di PET post-consumo sia trasparente che colorata a 55 °C in mezza giornata in un bioreattore a pH statico.

Le materie plastiche sono polimeri sintetici, con vantaggi di resistenza chimica, leggerezza e basso costo. Sono stati ampiamente utilizzati in tutto il mondo a partire dagli anni '50 e sono diventati essenziali nella nostra vita quotidiana1,2. Tuttavia, poiché la plastica non si decompone naturalmente, miliardi di tonnellate di rifiuti di plastica nelle discariche, galleggianti in isole di rifiuti nell’oceano e dispersi come microplastiche hanno portato a un grave inquinamento globale3,4,5,6,7. I governi e i produttori di plastica di tutto il mondo sono consapevoli di questi problemi e negli ultimi anni la ricerca e lo sviluppo incentrati sulle strategie di riciclaggio chimico e biologico dei rifiuti di plastica hanno subito un’accelerazione8,9,10.

Il polietilene tereftalato (PET), un poliestere composto da unità di acido tereftalico (TPA) e glicole etilenico, è un materiale di imballaggio in plastica ampiamente utilizzato ed è relativamente facile da riciclare. Negli ultimi due decenni sono stati condotti attivamente studi sulla degradazione biologica del PET8,11,12,13. La tecnologia di bioriciclaggio del PET comprende l’idrolisi del PET da parte di microrganismi o enzimi e la sua conversione in sostanze chimiche ad alto valore aggiunto, che in definitiva stabilisce un’economia circolare per il PET11,14,15,16.

Ad oggi sono stati scoperti e caratterizzati biochimicamente e strutturalmente diversi enzimi capaci di idrolizzare il PET. In particolare, la PETasi da Ideonella sakaiensis 201-F6 (IsPETase) mostra la più alta attività idrolitica del PET a temperatura ambiente ed è considerata un enzima promettente per il trattamento dei rifiuti di PET17. Di conseguenza, sono attualmente in corso vari studi di ingegneria enzimatica per migliorare l'efficienza dell'idrolisi del PET e la stabilità termica dell'IsPETase e sono state segnalate varianti con prestazioni migliorate18,19,20,21,22,23,24. Recentemente è stata scoperta la compost cutinasi dei rami fogliari (LCC) derivata dal metagenoma, che presenta proprietà termofile25. La sua variante ha dimostrato di esibire un'elevata attività di depolimerizzazione del PET in un sistema bioreattore a 72 °C, rendendolo un candidato per il riciclaggio biologico del PET26. Inoltre, si stanno compiendo sforzi per scoprire nuovi enzimi che degradano il PET ed enzimi provenienti da vari microrganismi e metagenomi ambientali, come Thermobifida fusca cutinasi (TfCut1,2)27, Thermomonospora curvata DSM43183 cutinasi (Tcur1278,0390)28, Bacterium HR29 (BhrPETase )29, Fusarium solani pisi (FsCut)30, Humicola insolens (HiC)31,32, PET233, PET533, PET633 e PHL734. E recentemente, le idrolasi PET termotolleranti sono state scoperte mediante l'estrazione del genoma in bioinformatica35.

Per un'applicazione fattibile dell'idrolisi enzimatica del PET, l'attività catalitica intrinsecamente elevata delle idrolasi del PET è un fattore cruciale come punto di partenza. Inoltre, sfruttare le proprietà termofile dell'idrolasi del PET è anche una strategia efficiente per lo sviluppo di idrolasi del PET superiori, poiché il funzionamento ad alta temperatura vicino alla temperatura di transizione vetrosa del materiale PET è favorevole alle prestazioni di degradazione del PET36. Pertanto, la scoperta di promettenti enzimi di degradazione del PET che abbiano sia un’elevata attività catalitica che elevate proprietà di termostabilità è fortemente necessaria per fornire informazioni sulla reazione di catalisi ed espandere la portata di biocatalizzatori PET efficienti.

40%) using I. sakaiensis PETase (Accession code: GAP38373.1) to query the model. Partial genes were removed from the retrieved sequences, and then sequences of the PETase candidates were randomly selected from the dataset. Multiple sequence alignment was performed using Clustal omega49. Phylogenetic reconstruction was performed via maximum likelihood (ML) using MEGA11 with the Dayhoff w/freq. model50,51. The tree with the highest log likelihood (−10401.10) is shown. Initial trees for heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using the JTT model, and then the topology with a superior log likelihood value was selected. Discrete gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among sites (5 categories [+G, parameter = 1.6961]). The rate variation model allowed for some sites to be evolutionarily invariable ([+I], 4.28% sites). This analysis involved 27 amino acid sequences, and there was a total of 444 positions in the final dataset. Bootstrap values were obtained from 1000 replicates52. Sequence alignment of enzymes used in phylogenetic tree analysis was depicted as a graphical illustration using ESPript3 (Supplementary Fig. 1)53. Pairwise identity and similarity of the proteins were calculated using the Clustal omega method, and a sequence identity matrix was created using excel software./p>